Le joueur contrôle toujours le personnage principal de la série qui est Desmond Miles. On retrouve également Lucy Stillman encore une fois interprétée par Kristen Bell (on notera que les doubleurs de ces deux personnages sont différents par rapport au premier dans la version française). Desmond incarne lui-même son ancêtre dans le monde de la mémoire génétique. Cet épisode fait l'objet d'un nouveau protagoniste dans une nouvelle époque : Ezio Auditore da Firenze, jeune noble italien qui vivait durant la Renaissance. Son père, Giovanni Auditore, était lui-même un Assassin allié à Laurent de Médicis qui combattait les Templiers.

Au xve siècle, Rodrigo Borgia est le principal antagoniste et grand maître de l'ordre des Templiers en Italie. Il est plus connu dans l'histoire en tant que pape Alexandre VI qu'il devient vers la fin du jeu. En 2012, la scène ayant changé du laboratoire d'Abstergo à la cachette des Assassins modernes, on rencontre deux nouveaux personnages chargés d'aider Desmond : Shaun Hastings, un programmeur et historien, et Rebecca Crane qui s'occupe de son « bébé », l'Animus 2.0.

Le récit reprend exactement là où le premier Assassin's Creed s'est arrêté : Desmond est face à des inscriptions étranges écrites en sang sur le mur de sa chambre qu'il voit grâce à la « vision d'aigle ». Lucy entre et lui demande de rentrer à nouveau dans l'Animus. Il assiste alors à la naissance d'un certain Ezio Auditore da Firenze. Les deux fuient ensuite rapidement le bâtiment d'Abstergo. Arrivé à un entrepôt qui semble être la cachette des Assassins, Lucy explique qu'elle voudrait avoir Desmond dans leur camp. Elle lui propose de s'entraîner rapidement grâce à l'effet secondaire de l'Animus qui lui permettra d'acquérir l'expérience d'Ezio, son ancêtre. Desmond accepte et rencontre le reste de l'équipe : Rebecca Crane qui s'occupe de l'Animus 2.0 des Assassins, et Shaun Hastings, tacticien et historien sarcastique. Desmond ne tarde pas à rentrer dans la machine…

Desmond se retrouve donc à Florence, en 1476, dans la peau d'Ezio, un jeune noble séducteur de 17 ans. On découvre sa famille, sa petite amie et ses ennemis. Un jour, sa famille est accusée de trahison, victime d'une conjuration. Son père et ses deux frères sont exécutés devant ses yeux. Il doit quitter la ville avec sa mère et sa sœur, se réfugiant dans le village de Monteriggioni où son oncle Mario tient une villa. Il lui révèle que le jeune homme est un Assassin, tout comme son père qui a été tué par les Templiers. Il débute alors sa quête de vengeance contre ceux qui ont tué les membres de sa famille. Sa longue aventure de 20 ans l'amène à voyager à travers diverses villes d'Italie telles que Venise et Forlì, et l'implique dans des évènements historiques comme la conjuration des Pazzi ou, dans des contenus supplémentaires du jeu, la bataille de Forlì ou le Bûcher des Vanités. Au fur et à mesure qu'il poursuit sa quête, il se rend compte qu'il est au centre d'une prophétie inscrite sur le codex de son ancêtre Altaïr.

En 1499, il se rend à Rome afin d'assassiner le pape Alexandre VI, alias Rodrigo Borgia, « l'Espagnol », chef des Templiers et le pape en Italie. Après un combat contre ce dernier dans une chambre secrète se trouvant sous la chapelle Sixtine, il l'épargne et accède au Sanctuaire. Un hologramme d'une femme se nommant Minerve l'accueille, et lui explique divers choses qu'Ezio a du mal à comprendre. Elle lui dit qu'elle ne veut pas parler avec lui mais à travers lui. Minerve raconte qu'elle est la dernière d'une race avancée qui a créé avec d'autres de son espèce les êtres humains. Mais ces derniers se sont rebellés et éclate ainsi une guerre entre les deux races. Personne n'a pu remarquer que la force magnétique de la Terre diminuait peu à peu, laissant la Terre sans défense face aux éruptions solaires. L'une d'elles provoquera une catastrophe terrible, anéantissant l'humanité et une grande partie du peuple de Minerve. Les quelques survivants reconstruiront la civilisation, et laisseront derrière eux des artéfacts pour permettre la survie face à d'autres catastrophes. Minerve raconte à Desmond qu'il devra chercher les autres temples sacrés construits par sa race pour pouvoir survivre à la nouvelle tragédie qui approche, et que tout repose maintenant sur lui. Ezio ne comprend pas la scène à laquelle il vient d'assister, pas plus que son descendant sortant de la machine. En effet il n'y a pas de temps pour se questionner ; les Templiers modernes ont attaqué la cachette. Desmond reçoit alors une lame secrète et repousse avec succès Warren Vidic accompagné de gardes grâce aux mouvements de son ancêtre qu'il a assimilés. Puis les quatre assassins repartent dans un camion avec l'Animus, en quête d'une nouvelle cachette...